levitra bitcoin

+7(495) 725-8986  г. Москва

Журналы

  • Серия
  • Серия
  • Серия
  • Серия
  • Журнал
  • Журнал
  • Журнал
  • Журнал

Т.Д. Сультимова,  (К.б.н., доцент, Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления)

Серия «Естественные и Технические науки» # 07 2018
Бактериоцин
    Потребительский спрос на минимально обработанные пищевые продукты или «свежую еду» без химических консервантов стимулировал исследователей на поиск натуральных антимикробных средств. Поэтому поиск бактериоцинов с улучшенными физико-химическими свойствами и широким антимикробным спектром представляет большой интерес для пищевой промышленности.
    Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е 234) является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков имеющий «GRAS» статус (признанный Европейским парламентом как безопасный), продуцентом которого является продуцентами которых являются разные штаммы одного вида Lactococcus lactis subsp. lactis. Изученные свойства штамма К205 Lactococcus lactis subsp. lactis и подбор компонентов среды для его культивирования описаны в данной статье.

Ключевые слова: Бактериоцин, Lactococcus lactis subsp. lactis, питательная среда, антибиотическая активность.

 

Бактериоциногения - биологический феномен, широко распространенный в природе и связанный с антагонизмом у бактерий. Исследования последних лет позволили выделить в самостоятельную категорию явлений антагонистическую активность микроорганизмов, характеризующуюся синтезом белковоподобных антибактериальных веществ с ограниченным диапазоном активности. Считают, что с практической точки зрения эти антибактериальные препараты, действующие на микрофлору избирательно, могут использоваться для нормализации микробного ценоза при некоторых патологиях у человека и животных.

Интерес по использованию бактериоцинов, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья. Широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е234), является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1997 года имеющий «GRAS» (Generally Recognized As Safe) статус, т.е. признанный Европейским парламентом как безопасный (European Parliament and Council, 1997). Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается с пищей, не токсичен. Описаны несколько форм низинов (А, В, С, D, Е, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, отличающихся между собой по ряду физико-химических свойств, аминокислотному составу и спектру антибактериального действия, но продуцентами которых являются разные штаммы одного вида Lactococcus lactis subsp. lactis. Поэтому интерес к получению «естественных антибиотиков», образуемых молочнокислыми бактериями в последние годы возрос.

Особый научный интерес представляют молочнокислые стрептококки серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. Изучение влияния компонентов питательной среды для культивирования продуцентов также является важным для получения сверхсинтеза бактериоцина.

Целью работы являлось изучить влияние компонентов питательной среды на биосинтез бактериоцина.

Объект исследования

Объектом исследования является ранее выделенный из национального кисломолочного напитка курунги штамм Lactococcus lactis subsp lactis К205. микробиологические среды: мясо-пептонный агар (МПА), молочный обрат, MRS, оптимизированная биосинтетическая среда следующего состава (%):КН2РО4- 0,5, MgSO4- 0,02, NaCl-0,2, глюкоза – 2,6, дрожжевой экстракт – 35-40 мг % азота аммония.

Методы исследования

В работе использованы классические микробиологические методы для выделения чистых культур микроорганизмов из природных источников и изучения морфологических и физиолого-биохимических свойств. Все полученные результаты оценивали в сравнении с данными Определителя бактерий Берги.

Культивирование микроорганизмов проводили при температуре 28°С в термостате в течение 24-х часов.

Морфологию выделенных микроорганизмов изучали по характеру роста на твердой питательной среде МПА и микроскопирования.

Устойчивость штамма к NaCl. Культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде с 4 и 6,5% NaCl при температуре 300С в течение 24 х часов. Рост или отсутствие роста штамма отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Определение роста культуры при рН 9,6. Культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде со значением рН 9,6 при температуре 300С в течение 24-х часов. Рост или отсутствие роста штамма отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на ФЭКе.

Определение роста культуры при различной температуре (100С, 400С, 450С). Культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде при разных значениях температур: 100С, 400С, 450С в течение 24-х часов. Рост или отсутствие роста штамма отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на ФЭКе.

Ферментативную активность в отношении потребления ряда углеводов, проводили по методу «пестрого ряда».

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культур Bacillus coagulans и Escherichia coli в мм. В качестве эталона для перевода в МЕ использовали соответствующие разведения антибиотического препарата Низаплин (Aplin &Barrett Ltd, Великобритания).

Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием дисков, пропитанных антибиотиком в концентрациях 2 - 75 мкг в диске и хранящихся во флаконах с влагоудерживателем (силикагелем).

Микроскопирование проводили на микроскопе Альтами БИО 8 при увеличении в 2000 раз.

Результаты исследований

Исследован штамм К205, находящийся долгое время на хранении. Для начала проведен ряд пересевов в чашки Петри со средой мясо-пептонный агар (МПА), а также с биосинтетической средой с добавлением индикатора бромкрезолового пурпурного. Инкубировали при 300С в течение 24 часов. Повторяли данную процедуру неоднократно, для подтверждения чистоты культуры. Затем проводили окрашивание по методу Грама и микроскопирование штамма на световом микроскопе при увеличении в 2000 раз.

В результате получили однородные колонии, которые образовывали зоны просветления вокруг себя при росте на биосинтетической среде с добавлением индикатора бромкрезолового пурпурного, что свидетельствовало об образовании кислоты и, соответственно, изменении уровня рН. В результате микроскопирования выявлено, что культура представлена грамположительными кокками, собранными в пары и короткие цепочки разной длины от 4-х до 7-ми кокков, что характерно для L. lactis subsp. lactis.

Свойство потреблять различные углеводы, включая сахара, спирты и органические кислоты лежит в основе отличительных признаков при идентификации молочнокислых бактерий.

Использован метод определения сбраживания углеводов исследуемым штаммом с использованием готовых растворов углеводов и индикатора бромкрезолового пурпурного в жидкой биосинтетической среде. Культивировали в течение 24 ч при 300С, после чего по изменению окраски среды и измерению оптической плотности отмечали результат (табл. 1).

Таблица 1.

Значение оптической плотности при определении сбраживания углеводов.

Углевод


Оптическая плотность (ОП670)

штамм К-205

1

2

Глюкоза

1,5

Арабиноза

1,1

Маннит

1,0

Ксилоза

1,0

 

В результате исследования определили способность сбраживания углеводов данным штаммом по измерению оптической плотности. Установлено, что в присутствии в питательной среде глюкозы наиболее благоприятна для роста культуры оптическая плотность, которой составляла 1,5. В среде содержащей арабинозу оптическая плотность составляла 1,4, маннит и ксилозу – 1,3.

Изучена антибиотическая активность штамма (таблица 2). Установлено, что бактериоцинобразующий штамм L. lactis subsp. lactis К205 подавляет рост грамположительной бактерии B. сoagulans.

Таблица 2.

Влияние углеводного компонента питательной среды на антибиотическую активность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis К 205.

Тест культура


Диаметр зон ингибирования роста бактерий, мм

Конт-роль

Глюко-за

Араби-ноза

Ксило-за

маннит

Nisaplin,
10 МЕ/мл

Nisaplin,
20 МЕ/мл

Nisaplin,
40 МЕ/мл

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Bacillus
coagulans

23

12

22

15

14

10

12

14

 

Наибольшее антимикробное действие оказывал штамм на среде с арабинозой, который по сравнению с контролем, содержащим в среде сахарозу, не оказал значительного повышения антимикробного действия.

Исследована потребность выделенных штаммов L. lactis subsp. lactis К205 в факторах роста - влияние 8 аминокислот (аспарагин, глицин, лизин, лейцин, метионин, аланин, глутаминовая кислота, глутамин), способных включаться в метаболизм лактококков (таблица 3).

Таблица 3.

Влияние аминокислот на антибиотическую активность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis К205.

Компоненты


Диаметр зон подавления роста, мм

К 205-1

Nisaplin,
40 МЕ/мл

Nisaplin,
20 МЕ/мл

Nisaplin,
10 МЕ/мл

1

2

3

4

5

аспарагин

18

15

14

12

глицин

15

15

14

12

лизин

12

15

14

12

лейцин

12

15

14

12

метионин

13

15

14

12

аланин

14

16

13

12

глутаминовая кислота

13

15

14

11

глутамин

12

15

12

11

Контроль со штаммом

13

15

14

12

 

Наибольшее антимикробное действие оказывал штамм на среде с аспарагином и глицином.

В результате в дальнейших исследованиях использовалась питательная среда, содержащая аспарагин.

По результатам изучения чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам (таблица 4), выявлено, что штаммы чувствительны к антибактериальным антибиотикам широкого спектра действия, ингибирующим синтез белка: клиндамицину, карбенициллину, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам: гентамицину, амикацину. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки: цефоперазону, бензилпенициллину, ванкомицину, ципрофлоксацину, амоксициллину.

Таблица 4.

Чувствительность штаммов L. lactis subsp. lactis К 205 к антибиотикам.

Антибиотик

Концентрация в диске, мкг


Диаметр зон подавления роста, мм

К 205-1

1

2

3

Пефлоксацин

5

12

Клиндамицин

2

15

Азтреонам

30

-

Ванкомицин

30

19

Ципрофлаксацин

5

15

Фузидин

10

25

Цефтриаксон

30

-

Амоксициллин

20

35

Гентамицин

10

-

Амикацин

30

-

Меропенем

10

12

Цефоперазон

75

30

Норфлоксацин

10

7

Карбенициллин

25

15

Бензилпенициллин

6

17

Клиндамицин

2

10

 

Чувствительность к антибиотическим препаратам может быть следствием их применения в сельскохозяйственной практике. В связи с этим, контроль по данному показателю является необходимым, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам в пищевой и медицинской практике, могут передаваться в макроорганизм плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, что затрудняет лечение.

В результате проведенной работы установлена чистота культуры Lactococcus lactis subsp. lactis К205, исследовано влияние углеводного компонента на рост и бактериоцинпродуцирующую активность штамма. Выявлено, что присутствие в среде арабинозы увеличивало антибиотическую активность, но по сравнению с контролем, содержащим сахарозу, активность штамма ниже. Исследовано влияние аминокислот на рост и активность штамма. Выявлено, что содержание в среде аспарагина увеличивает антибиотическую активность штамма-продуцента. Таким образом, произведен подбор основных компонентов питательной среды, что позволило повысить антибиотическую активность штамма К205 Lactococcus lactis subsp. lactis.

Изучено влияние антибиотиков на рост культуры. Выявлено, что штамм чувствителен к антибактериальным антибиотикам широкого спектра действия, ингибирующим синтез белка и синтез клеточной стенки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Стоянова, Л. Г. Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий / Т. Д. Сультимова, А. И. Нетрусов // Цитология. − 2004. − Т. 46. − №10. − С. 865-867.
2. Стоянова, Л. Г. Микробиологическая характеристика нового штамма Lactococcus lactis ssp. lactis K-205 / Т. Д. Сультимова , А. Р. Строeва, А. И. Нeтрусов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. − 2008. − № 1. − С. 60-63
3. Квасников, Е. И. Молочнокислые бактерии и их использование / О. А. Нестеренко // М.: Наука.– 2003.– 348 с.
4. Стоянова, Л. Г. Молочнокислые бактерии // Практикум по микробиологии. Под ред. А. И. Нетрусова. − М. Изд. Академия. − 2005. − С. 467 – 486.
5. Хоулт Дж. Определитель бактерий Берджи. т. 1 // М.: Наука. – 1997. – 421 с.
6. Хоулт Дж. Определитель бактерий Берджи. т. 2 // М.: Наука. – 1997. – 325 с.


©  Т.Д. Сультимова, Журнал "Современная наука: актуальные проблемы теории и практики".
 

 

 

 
SCROLL TO TOP
viagra bitcoin buy

������ ����������� Rambler's Top100 �������@Mail.ru